Alternative CO2-emissionfreie Energieträger gewinnen zunehmend an Bedeutung auf Grund des globalen Rückgangs der Ressourcen von fossilen Energieträgern sowie der Problematik steigender CO2-Konzentrationen. Pflanzen, Cyanobakterien und Grünalgen nutzen die oxygene Photosynthese, um Sonnenlicht in chemische Energie umzuwandeln. Neben einigen anderen Mikroorganismen ist die einzellige Grünalge Chlamydomonas reinhardtii darüber hinaus in der Lage, unter anaeroben Bedingungen Sonnenlichtenergie zur Produktion von molekularem Wasserstoff im Chloroplasten zu nutzen. Dabei werden Protonen (H+) und Elektronen (e-) auf Sauerstoff-sensitive Hydrogenasen (HydA1 und HydA2) übertragen, welche die Produktion von molekularem Wasserstoff katalysieren. Die für diesen Prozess notwendigen Protonen (H+) und Elektronen (e-) können dabei entweder direkt vom wasserspaltenden Photosystem (PS) II stammen, oder ausgehend vom Abbau gespeicherter Biomoleküle (wie z.B. Stärke) den Hydrogenasen zugeführt werden.Zur Verbesserung des Aufbaus von Biomasse und des Ertrags der Wasserstoffproduktion in Chlamydomonas reinhardtii sollen in meinem Projekt verschiedene molekulare Parameter der Versorgungsmechanismen der Hydrogenasen mit (H+) und (e-) untersucht und optimiert werden. Eine optimale Grundlage dieses Forschungsprojektes bietet die im Labor der AG PD Dr. Kruse hergestellte Wasserstoffproduktionsmutante Stm6, die in der Lage ist, je nach Bedingungen 4,5 - 13 mal mehr Wasserstoff als der Wildtyp zu produzieren. Damit konnte eine Erhöhung der Photonenübertragungseffizienz (PCE-Rate; Prozentualer Anteil der Umwandlungsrate aufgenommener Lichtphotonen in H2) in Grünalgenkulturen von 0.1% auf ca. 1.6% erreicht werden. In zwei Projektmodulen soll der Aufbau von Biomasse und der Ertrag der Wasserstoffproduktion in Chlamydomonas reinhardtii untersucht und weiter optimiert werden.Im ersten Modul meiner Arbeit habe ich die Klonierung und Expression eines Zuckertransportergens (HUP1) in Stm6 erfolgreich durchgeführt und die hergestellte Mutante charakterisiert (Doebbe et al., (2007), J. Biotechnol.). Dadurch konnte eine neue Zelllinie, Stm6Glc4, entwickelt werden, welche sowohl Wasser (66%) als auch Glukose (33%) zur H2-Produktion verwenden kann. Des Weiteren besitzt Stm6Glc4 eine deutlich erhöhte Kapazität zur Wasserstoffproduktion unter Glukose Zugabe. Stm6Glc4 produziert derzeitig etwa 50% mehr Wasserstoff als Stm6. Hierzu ist schon eine relativ geringe Menge an Glukose (1 mM) ausreichend. Die Zufütterung von Glukose eröffnet neue Möglichkeiten, Zuckerabfall aus der Zuckerrohr- und Zuckerrübenindustrie energetisch sinnvoll zur Produktion eines Bio Kraftstoffs zu verwenden. Im zweiten Modul sollten die Metabolitspiegel (Metabolom) im Verlauf des Wasserstoffproduktionszyklus aufgenommen und analysiert werden, um zu verstehen, welche Anpassungsvorgänge sich in der Grünalgenzelle während der H2-Produktion abspielen. Die Entwicklung der C. reinhardtii Zelllinie Stm6Glc4 bietet, auf Grund der nun möglichen Aufnahme markierter Glukose, neue Möglichkeiten, metabolische Stoffwechselwege zu untersuchen. Diese Fähigkeit soll genutzt werden, genauere Einblicke in die Stoffwechselprozesse zu erhalten welche ablaufen, wenn Glukose abgebaut und zur Produktion von Wasserstoff umgesetzt wird. Zudem können mit der neuen Mutante Genexpressionsanalysen durchgeführt werden, um neue Zielgene zu identifizieren, welche für eine hohe Rate der H2 Produktion verantwortlich sind. Das Metabolom der Transformante Stm6Glc4 sollte zudem mit dem des Wildtyps verglichen werden, um potentielle Schlüsselmetabolite der H2-Produktion zu detektieren. Bislang werden Metabolomuntersuchungen überwiegend mittels Gas-Chromatographie und anschließender Massenspektrometrie (GC-MS) durchgeführt. Neben dieser Methode wurde im Rahmen meines Projekts erfolgreich eine neue Methode, GCxGC-TOFMS, etabliert, um die Anzahl der detektierbaren Metabolite zu erhöhen. Im Verlauf der H2-Produktion wurden einige wesentliche Veränderungen der Metabolitspiegel ersichtlich. Die Spiegel der Intermediate des Citratzyklus waren vor der H2-Produktion am höchsten, die Intermediate der Glykolyse hingegen während der H2-Produktion. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass der Gehalt der freien Fettsäuren während der H2-Produktion stark anstieg.