Etablierung einer nachhaltigen biokatalytischen Synthese von ß-Aminosäuren durch Verbesserung der Regioselektivität von Baeyer-Villiger-Monooxygenasen mittels Proteinengineering und Untersuchungen zum Einfluss von Sauerstoff auf die Produktbildung

Stipendiatin/Stipendiat: Dr. Kathleen Balke

ß-Aminosäuren sind von großem Interesse für die pharmazeutische Industrie, da sie als Bausteine für die Herstellung von ß-Peptiden, Alkaloiden, Terpenoiden und ß-Laktam-Antibiotika dienen. Da chemische Synthesen meist nicht so selektiv verlaufen wie enzymatische und bei der chemischen Synthese häufig umwelt- und/oder gesundheits-schädliche Stoffe eingesetzt werden müssen, ist es vorteilhaft alternative, nachhaltige enzymatische Reaktionen nutzen zu können. Die enzymatische Herstellung von ß Aminosäuren konnte u.a. durch die abnormale Baeyer-Villiger-Oxidation mit Baeyer-Villiger-Monooxygenasen (BVMOs) gezeigt werden. Da die Faktoren welche die abnormale Produktbildung bei BVMOs begünstigen bisher kaum verstanden sind, ist es Ziel meiner Dissertation das Verständnis für die Regioselektivität von BVMOs zu verbessern, so dass die Palette durch BVMOs zugänglicher Produkte erweitert werden kann.
Bisher konnten mehrere Substrate, welche zur Untersuchung der Regioselektivität getestet werden sollen, synthetisiert werden. Außerdem wurden Expressionsoptimierungen von den zu untersuchenden Enzymen erfolgreich durchgeführt und erste Experimente zur Reproduktion der publizierten Ergebnisse bearbeitet.

Anhand einer bestehenden Kristallstruktur wurde ein Homologiemodell für eine der zu untersuchenden BVMOs erstellt. Die Substrate wurden in die Struktur gedockt und 13 möglich relevante Aminosäurereste identifiziert, die an der Substratpositionierung beteiligt sein könnten. Davon ausgehend wurden 28 Mutanten generiert, welche dann auch erfolgreich exprimiert und in Biokatalysen eingesetzt werden konnten. 7 potentiell interessante Mutanten wurden identifiziert, welche nun eingehender studiert werden sollen.

Nach Identifizierung einer sehr vielversprechenden Mutante wurden weitere Dockingstudien durchgeführt und weitere Mutanten hergestellt. Nach Untersuchung der neuen Mutanten wurden vier Dreifachmutanten identifiziert, welche eine fast vollständig umgekehrte Regioselektivität aufwiesen. Die beste Mutante soll nun ausführlich charakterisiert werden.

Förderzeitraum:
01.06.2013 - 30.09.2017

Institut:
Universität Greifswald Institut für Biochemie Arbeitsgruppe für Biotechnologie und Enzymkatalyse

Betreuer:
Prof. Dr. Uwe T. Bornscheuer

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